離心機用于腺病毒體外在293細胞中大量擴增

更新時間：2012-08-24

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一旦重組病毒已被純化和鑒定，即可在293 細胞中進行大量擴增。本手冊提供了遞增培養(yǎng)規(guī)模和腺病毒感染周期的基本方法，按這一方法zui終得到的病毒量約為3×10¹¹～3×10¹²。由于一個細胞中所含的病毒顆粒為1000～10000，因此1L 培養(yǎng)細胞可得到約5×10¹²病毒顆粒。如果要把病毒用氯化銫梯度離心純化，則必須至少3×10⁸的細胞，這樣才能正確分辨出病毒帶。對于蛋白表達，則根據(jù)需要可在任何一步擴增步驟中停止，離心沉淀細胞后按照適當?shù)牟僮鞣椒ㄟM行蛋白抽提（根據(jù)蛋白類型的不同抽提上清或細胞沉淀）。為優(yōu)化時間進程，每個感染周期必須與下一次細胞擴增培養(yǎng)同步。如果由于各種原因不能同步，則必須將病毒凍存，直至下一次細胞培養(yǎng)開始后再融化病毒。注意每次擴增都將會剩下一些病毒，這些病毒先不必丟棄，以便下一步擴增失敗時備用。每次擴增都用zui低代的病毒顆粒，這樣產(chǎn)生突變型病毒的可能性會大大降低。

操作步驟：

1 在100mm 培養(yǎng)皿或75cm²培養(yǎng)瓶中加入10ml DMEM5%培養(yǎng)5×10⁶293 細胞。

2 取0.5ul 擴增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混勻，這樣稀釋得到的MOI 值約為5。

3 移去培養(yǎng)液，小心加入病毒混合液，切勿破壞細胞單層，十字形慢慢晃動3 次，37℃ CO2 孵箱中培養(yǎng)90 分鐘。

4 加入9ml DMEM5%。

5 再培養(yǎng)72 小時，這時在10ml 溶液中大約有5×10⁹～5×10¹⁰個病毒顆粒，進行MOI 測定以估計病毒顆粒。

注：如果此時得到的病毒量已足夠，可立即進行病毒滴度測定。收集細胞，600×g 離心5 分鐘沉淀細胞，去上清后加入zui小體積（一般為原始體積的1/10 即1ml）病毒保存溶液重懸細胞。-20⁰C /37⁰C 凍融3 次，臺式離心機上以zui大速率離心去除細胞碎片，收集上清，然后進行病毒滴定。

1 -20℃/37℃凍融3 次。

2轉入15ml 無菌離心管中，臺式離心機上以zui大速率離心10 分鐘，收集上清凍存于-20 ℃或-80 ℃。

3 3 個175cm²培養(yǎng)瓶中各加入10⁷ 293 細胞進行培養(yǎng)。

4 將3ml 細胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混勻。移去細胞培養(yǎng)液，每瓶小心加入5ml 混合液，十字形慢慢晃動混勻3 次，37⁰C 5%CO2 孵箱中培養(yǎng)90 分鐘。此時MOI 值約為25。

5 加入DMEM5%至30ml。

6 再培養(yǎng)48～72 小時。此時10ml 培養(yǎng)液病毒量約為3×10¹⁰～3×10¹¹。若需要，進行MOI 測定以估計病毒滴度。

注：如果此時病毒量已可以滿足實驗所需，則可立即進入病毒滴定步驟。600×g 離心5 分鐘收集細胞，棄上清，加入1/10 原始體積的溶液重懸細胞。-20⁰C /37⁰C 凍融3 次，臺式離心機上以zui大速率沉淀細胞碎片，收集上清，進行病毒滴定。

12. 移入50ml 離心管中，臺式離心機上zui大速率離心10 分鐘，取出上清保存。

13. 30 瓶175 cm2 培養(yǎng)瓶中每瓶各加入10⁷ 293 細胞。

14. 將45ml 細胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混勻，從培養(yǎng)瓶中移去培養(yǎng)液，加入5ml 混合液感染細胞，十字形緩慢晃動3 次混勻，370C 培養(yǎng)90 分鐘。此時MOI 值約為25。

15. 加入DMEM5%至30ml/瓶。

16. 再培養(yǎng)48-72 小時，此時約有3×10¹¹～3×10¹²個病毒。若需要，進行MOI 測定估計病毒滴度。

如果要收集病毒顆粒，先收集被感染細胞，然后重懸在5ml DMEM5%中。-20⁰C /37⁰C 凍融3 次，離心沉淀細胞碎片。此時5ml DMEM5%中3×10¹¹～3×10¹²個病毒顆粒，濃度為6×10¹⁰～6×10¹¹vp/ml。然后測定病毒滴度，或者用標準的氯化銫密度梯度離心法純化病毒。

在109 細胞中擴增病毒可獲得大量病毒保存液，而在1010 細胞中擴增則有一定技術性。切勿將擴增后的病毒保存液再用來感染細胞，因這會大大增加RCA 產(chǎn)生量。有時不得不使用純化空斑以zui大可能降低RCA 產(chǎn)量。如果已沒有純化的空斑，那么就不得不重新空斑純化重組病毒，鑒定克隆后再進行擴增。如果需要大于擴增4 輪后的病毒量，注意請用早期的病毒作為擴增源。比如，用第2 代病毒產(chǎn)生第3 代病毒。如果沒有第2 代病毒，那么必須用第1 代病毒來產(chǎn)生新的第2 代病毒。按這個原則進行擴增可使RCA 水平盡可能低。

如果用于表達蛋白，則可以收集細胞后根據(jù)蛋白特點選擇適當方法抽提蛋白。細胞沉淀中一般可提取1-5mg 蛋白，建議在小規(guī)模擴增后先測定感染后抽提蛋白的*時間，然后再大量擴增蛋白。

腺病毒擴增

*代		第二代	第三代	第四代
每瓶細胞數(shù)	1×105	5×106	1×107	1×107
培養(yǎng)瓶大小（cm2）		75	175	175

培養(yǎng)瓶數(shù)	24 孔板1 孔	1	3	30
		擴增后的病
感染來源	稀釋的空斑		第二代病毒	第三代病毒
		毒保存液
		0.5 mL 或
每瓶接種量	0.1 mL		1 mL	1.5 mL
		2.5×107
總培養(yǎng)體積	1 mL	10 mL	90 mL	900 mL
MOI	0.01	5	25	25
滴度（VP/mL）	1×108～9	5×108～9	3.3×108～9	3.3×108～9
總病毒量	1×108～9	5×109～10	3×1010～11	3×1011～12

來源：低速離心機

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